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Molecular Biologynaa20+ (SPCC16C4.12) and naa25+ (SPBC1215.02c) genes were amplified from genomic S. pombe DNA as Nde1-BamH1 and Sal1 fragments respectively and cloned into pGEM-T-Easy (Promega). Introns were removed sequentially by ligating blunt ended products of PCR reactions where appropriate primers had been... 顯示更多 Molecular Biologynaa20+ (SPCC16C4.12) and naa25+ (SPBC1215.02c) genes were amplified from genomic S. pombe DNA as Nde1-BamH1 and Sal1 fragments respectively and cloned into pGEM-T-Easy (Promega). Introns were removed sequentially by ligating blunt ended products of PCR reactions where appropriate primers had been used to amplify the entire plasmid lacking individual introns. Subsequent cDNAs were sequenced and cloned into pACYCduet (Novagen), each under the control of separate T7 promotors, to generate pACYCduet-naa20+-naa25+ (pNatB). BL21 DE3 cells were co-transformed with pACYCduet-naa20+-naa25+ and a pJC20 plasmid containing the cDNA encoding for the appropriate target protein also under the control of the T7 promoter (pTarget).Cell CultureE. coli cells were cultured in NZY medium (1.0% Casein hydolysate (NZ amine), 0.5% NaCl, 0.5% yeast extract, 20 mM D-Glucose, 12.5 mM MgCl2 and 12.5 mM MgSO4) supplemented with appropriate antibiotics, and were grown in baffled Erlenmeyer flasks at 37°C with vigorous shaking. T7 dependent expression was induced by addition of IPTG (100 μg/ml final concentration) once cell cultures had reached an OD600 of 0.4–0.5. Cells were harvested 4 hr after induction with IPTG. Protein expression was assessed by separating whole cell lysates using SDS-PAGE and visualizing proteins with Coomassie blue stain.Biochemical techniquesTropomyosin proteins were expressed and purified as described previously [6], while poly-histidine tagged proteins were purified on nickel columns (Qiagen) in denaturing conditions (8 M urea, 0.1 M NaH2PO4 0.01 M Tris-Cl). Protein concentrations were determined using 280 nm extinction coefficients of 2,980 cm?1, 27,600 cm?1, 27,550 cm?1 and 64,070 cm?1 for Cdc8, α-SkTm, Tfs1 and Spartin respectively. Protein mass was determined using a Finnegan Mat LCQ ion-trap mass spectroscope. Cosedimentation assays were performed at 25°C as described previously [14].
最佳解答:
分子生物學 naa20 +（SPCC16C4.12）和naa25 +（SPBC1215.02c）基因擴增基因組 DNA為 Nde1學酵母- BamH1和Sal1片段分別克隆到pGEM - T -易（Promega公司）。內含子被拆除順序鈍端結紮產品在適當的引物PCR反應已用於擴增整個質粒缺乏個人內含子。隨後的基因進行測序，克隆到pACYCduet（Novagen），每個單獨的控制下T7號助劑，產生 pACYCduet - naa20 + - naa25 +（pNatB）。大腸桿菌 BL21 DE3細胞共轉化與 pACYCduet - naa20 + +和pJC20 naa25質粒的基因編碼的蛋白質也相應的目標控制下的T7啟動子（pTarget）。 細胞培養 大腸桿菌細胞進行培養 NZY培養基（1.0％酪蛋白hydolysate（新西蘭胺），0.5％氯化鈉，0.5％酵母提取物，20毫米D -葡萄糖，12.5毫米和12.5毫米氯化鎂硫酸鎂），輔以適當的抗生素，生長莫名其妙燒瓶中於 37 ° C的劇烈搖晃。 T7啟動依賴性表達誘導此外，經 IPTG（100微克/毫升的最終濃度）曾經培養過細胞的OD600值達到 0.4-0.5。細胞收穫 4小時後，以IPTG誘導。蛋白的表達，評估的全細胞裂解液中分離用SDS - PAGE和可視化蛋白質與考馬斯亮藍染色。 生化技術 原肌球蛋白的蛋白表達和純化參照文獻 [6]，而聚組氨酸標記蛋白進行純化，對鎳列（Qiagen公司）在變性條件（8米尿素，磷酸二氫鈉 0.01米0.1米的Tris - Cl計）。蛋白質濃度的確定，採用 280 nm的消光係數二九八〇厘米- 1，二七六○○厘米- 1，二萬七千五百五十○厘米 - 1和64070厘米- 1 Cdc8，α- SkTm，分別 Tfs1和互花米草。蛋白質的質量是決定使用芬尼根墊 LCQ離子阱質譜儀。 Cosedimentation檢測分別在25 ° C為文獻 [14]。 諾以上是英文的話就是縮寫或英文名字(要不然就是我不知道SORRY)
其他解答:
分子生物學naa20 + (SPCC16C4.12) 和 naa25 + Nde1 BamH1 和 Sal1 的片段作為從基因組 S.殖 DNA 擴增分別 (SPBC1215.02c) 的基因並克隆到 pGEM T 容易 (栽)。內含子按順序拆除結紮鈍終了的產品，在適當的引物已被用於放大缺乏個人內含子的整個質粒的 PCR 反應。隨後擴增了排序，然後到 pACYCduet （Novagen） 生成 pACYCduet 的單獨 T7 助劑控制下的每個克隆-naa20 +-naa25 + (pNatB)。BL21 崇德 3 儲存格是 co-transformed 與 pACYCduet-naa20 +-naa25 + 和 pJC20 載體也 T7 啟動子 (pTarget) 的控制下的適當的目標蛋白的基因編碼。細胞培養大腸桿菌細胞培養輔以適當的抗生素的 NZY 介質 （1.0%酪蛋白 hydolysate (NZ 胺)、 0.5%氯化鈉、 0.5%酵母提取物、 20 毫米 D-葡萄糖、 12.5 毫米 MgCl2 和 12.5 毫米 MgSO4） 中，共種植折流板茯苓瓶在 37 ° C，猛烈搖晃。T7 依賴表達誘導了 IPTG （100 微克/毫升最後濃度） 此外一旦細胞培養達到了一個 OD600 的 0.4–0.5。細胞是 IPTG 誘導後的收穫 4 小時。由全細胞裂解分離蛋白表達評估使用電泳和視覺化與馬斯蛋白質藍色著色。生化技術原肌球蛋白蛋白是表示和純淨如前面所述 [6] 雖然標記的聚組氨酸蛋白純化對鎳列 (Qiagen) 在變性的條件 (第尿素 8 M M NaH2PO4 0.1 0.01 米席 Cl）。蛋白濃度確定使用的 2,980 cm?1、 27600 cm?1、 27,550 cm?1 和 64,070 cm?1 280 nm 消光係數為 Cdc8，α SkTm Tfs1 Spartin 分別。蛋白質質譜決心使用芬尼根墊立法會題離子阱質譜儀。25 ° C 所述以前 [14] 進行了 cosedimentation 的檢測方法。|||||分子生物学 naa20+ (SPCC16C4.12)和naa25+ (SPBC1215.02c)基因從genomic S. pombe脫氧核糖核酸被放大了， Nde1-BamH1和Sal1各自片段並且被克隆了入pGEM T容易(Promega)。 只要適合的話綁紮PCR反應底漆直言的成品繼續地去除基因內區使用放大缺乏各自的基因內區的整個質粒。 隨後cDNAs程序化並且被克隆入pACYCduet (Novagen)，其中每一受分開的T7贊助人的控制，引起pACYCduet-naa20+-naa25+ (pNatB)。 BL21 DE3細胞co變換了與pACYCduet-naa20+-naa25+和也包含適當的目標蛋白質的pJC20質粒cDNA內碼受T7促進者(pTarget)的控制。细胞培养用適當的抗生素在NZY媒介(1.0%酪蛋白hydolysate (NZ胺物)， 0.5% NaCl、0.5%酵母抽提物、20 mM D葡萄糖， 12.5 mM氯化鎂和12.5 mM MgSO4)在37°C的被難倒的锥形烧瓶被開化了補充的大腸埃希氏菌細胞和增長與蒼勁震動。 T7依賴表示被IPTG導致(100 μg/ml最後的集中)的加法，一旦细胞培养到達了OD600 0.4-0.5。 細胞被收穫了4 hr在與IPTG的歸納以后。 分離整體細胞lysates估計蛋白質表示使用SDS-PAGE，並且與Coomassie藍色的形象化的蛋白質弄髒。生物化學的技術原肌球蛋白蛋白質被表達了並且淨化了如所描述以前[6]，而多組氨酸被標記的蛋白質在鎳專欄(Qiagen)被淨化了在弈質情况(8 M尿素， 0.1 M NaH2PO4 0.01 M Tris分類)。 蛋白質含量使用280個毫微米消光系数分别為堅定的2,980 cm?1、27,600 cm?1、27,550 cm?1和Cdc8、α-SkTm、Tfs1和Spartin的64,070 cm?1。 蛋白質大量使用Finnegan蓆子LCQ是堅定的離子設陷井质谱仪。 Cosedimentation分析用試樣執行了在25°C如所描述以前[14]。
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